行业动态 >> 黄素B1的免疫荧光检测法

利用免疫亲和层析-荧光光度法测定饲料中的黄曲霉毒素B1

 

摘  要:利用免疫亲和层析-荧光光度法对饲料中的黄曲霉毒素B1进行测定,测得其相关系数为0.9899,平均回收率为97.66%,各重复之间的变异系数均小于15%,阳性可用HPLC法进行确认,具有高效、快速、准确、安全等特点。

关键词:黄曲霉毒素B1,免疫亲和层析,荧光光度法,饲料

 

黄曲霉毒素B1是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物,含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮(香豆素)。前者为基本毒性结构,后者与致癌有关。黄曲霉毒素B1是已知各种真菌毒素中最稳定的一种。结晶的AFB1在高温(200℃)及紫外照射下都不被破坏。在所有真菌毒素中,黄曲霉毒素B1的毒性、致癌性、污染频率均居首位。因此,研究黄曲霉毒素B1快速准确的检测方法具有十分重要的社会和经济效益。

    在我国,饲料中黄曲霉毒素B1常用的检测方法有薄层色谱法(TLC)和酶联免疫吸附法(ELISA),而对饲料中黄曲霉毒素B1的免疫亲和柱-荧光分光光度法研究得较少。免疫亲和柱是用大剂量的黄曲霉单克隆抗体固化在水不溶性的载体上,然后装柱而成。黄曲霉毒素免疫亲和柱-荧光分光光度法是以单克隆免疫亲和柱为分离手段,用荧光计、紫外灯作为检测工具的快速分析方法。它克服困难TLC法在操作过程中使用剧毒的真菌毒素作为标定标准物和在样品预处理过程中使用多种有毒、异味的有机溶剂,毒害操作人员和污染环境的缺点。用检测黄曲霉毒素B的方法将黄曲霉毒素B1、B2分离出,用高效液相色谱(HPLC)方法测定B1的含量。本文中对利用免疫层析法-荧光光度法检测饲料中黄曲霉毒素B1的方法性能进行研究。

 

1 材料与方法

1.1 试剂和溶液

1.1.1 甲醇:色谱纯。

1.1.2 甲醇+水(8+2)。

1.1.3 氯化钠。

1.1.4 PBS缓冲溶液:称取8.0g氯化钠,1.2g磷酸氢二钠,0.2g磷酸二氢钾,0.2g氯化钾,用990mL纯水溶解,然后用浓盐酸调节pH值到7.0,最后用纯水稀释至1000mL

1.1.5 吐温-20/PBS溶液(0.1%):取1mL吐温-20,加入PBS缓冲溶液并定容至1000mL

1.1.6 pH7.0磷酸盐缓冲溶液:取25.0mL 0.2mol/L的磷酸二氢钾溶液与29.1mL 0.1mol/L的氢氧化钠溶液混匀后,稀释到100mL

1.1.7显色液。

1.1.8 猪配合饲料。

1.2 仪器设备

1.2.1 黄曲霉毒素B系统免疫亲和柱(北京中检维康提供)。

1.2.2 玻璃纤维滤纸:直径11cm,孔径1.5μm

1.2.3 玻璃试管:直径12mm,长75mm,无荧光特性。

1.2.4 荧光分析仪。

1.2.5高速均质器:18000r/min~22000r/min

1.3 试验方法

1.3.1 试验准备

1.3.1.1 标定荧光计。

1.3.1.2 每天配制AflaTest显色液。

1.3.1.3 配制甲醇/水(8020 体积比)溶液(每周或按需要)。

1.3.1.4 试剂空白试验(1mL 甲醇+ 1 mL 显色液置于试管中),荧光计读数应为。

1.3.1.5 空白试验(2mL纯水置于测试管中),荧光计读数应为0

1.3.2 样品提取

1.3.2.1 称取50g磨细的样品,5NaCl,置于搅拌杯中。

1.3.2.2 加入100 mL甲醇/水(80:20)溶液。

1.3.2.3 盖上搅拌杯的盖子,高速搅拌1分钟。

1.3.2.4 取下盖子,将提取物通过折叠式滤纸过滤,滤液收集于干净的容器中。

1.3.3 提取物的稀释

1.3.3.1 移取10 mL上步的滤液,置于干净的容器中。

1.3.3.2 40 mL纯水将滤液稀释,混匀。

1.3.3.3 将上步稀释液通过微纤维滤纸过滤,滤液收集于玻璃注射器筒中,量取10mL

1.3.4 分离柱色谱操作

1.3.4.1 将上步10mL滤液,1-2/秒的流速全部通过Afla B亲和柱,直至空气进入到亲和柱中。

1.3.4.2 10 mL真菌毒素清洗缓冲液以1-2/秒的流速通过亲和柱。

1.3.4.3 10 mL纯水以1-2/秒的流速通过亲和柱,直至空气进入到亲和柱中。

1.3.4.4 1.5 mL Afla B淋洗液以约1 /秒的流速淋洗亲和柱,将所有样品洗脱液(1.5 mL)收集于玻璃测试管中。

1.3.4.5混匀后,立即将测试管置于已标定好了的荧光计中。60秒后,读数。

1.3.5 往饲料进行添加,分别做线性试验、回收率及重复性实验。

2 结果与分析

2.1 线性(猪配合饲料)

       相关系数为0.9899

 

2.2 回收率

1 黄曲霉毒素B1回收率试验

添加浓度(ppb)

1.6

3.2

6.4

8.0

实测浓度(ppb)

1.52

2.92

7.12

7.45

回收率(%

95.00

91.25

111.25

93.12

 

平均回收率为97.66%,各重复之间变异系数均小于15%

 

2.3 确认试验

       利用高效液相色谱法可以进行确认和准确定量。

2 黄曲霉毒素B系列的标准图谱

 

3 结论与讨论

传统的薄层层析法在检测黄曲霉毒素B1时,具有以下缺点:

⑴为满足黄曲霉毒素B1检测过程对层析柱设备和洗脱流速的要求,一个人一批最多只能做3~4个样品,不能满足大批量样品的检测任务。

⑵检测中需要大量和多种的有机溶剂,如三氯甲烷、乙醚、甲醇、乙腈、正已烷等。在检测大批量的样品(如国家抽查样品)时,需要使用大量的有机溶剂,对检测、废液回收等都带来较大困难。

⑶由于黄曲霉毒素B1本身具有剧毒,而在检测过程中又需要使用大量溶剂,定性时需要使用三氟乙酸、消毒时需要使用次氯酸钠等有毒或刺激性物质,若在进行大批量的检测时,即使通风条件良好,检测人员戴上口罩和手套,仍会感到喉咙干燥,眼睛刺痛。因此不利于检测人员的健康和安全。

⑷点板操作起来比较困难,不同的重复、不同的检测人员之间均会有一定的差异。

⑸检测结果与硅胶板的层度、均匀度有很大关系,也会给结果带来不稳定性。

⑹定量检测时需完全凭借检测人员的眼力来目测,较难得出准确的结果,而且不同的检测人员之间也可能得出不同的结果。

ELISA法往往对大批量的样品使用较方便,若检测样品量较少时,则反而麻烦,价格也较贵,而且阳性结果也必须经过鉴定。

总之,免疫层析亲和-荧光光度法既可适合大批量样品检测,也适合小批量样品的检测,而且具有快速、准确、安全的优点。

中心实验室 发布时间:  2017/8/15 13:08:00 浏览量:  300