行业动态 >> 伏马毒素免疫荧光检测法

饲料中伏马毒素的测定  免疫亲和柱-荧光光度法

Determination Fumonisin in Feed - Cleanup by immunoaffinity columns and determination by Fluorometer

 

摘  要:利用免疫亲和层析-荧光光度法对饲料中的伏马毒素B2进行测定,测得其相关系数为0.9589,平均回收率为89.22%,各重复之间的变异系数均小于15%,阳性可用HPLC法进行确认,具有高效、快速、准确、安全等特点。

关键词:伏马毒素B2,免疫亲和层析,荧光光度法,饲料

 

伏马毒素是由串珠镰刀菌等产生的真菌毒素,可导致马产生白脑软化症(ELEM),神经性中毒而呈现意识障碍、失明和运动失调,甚至造成死亡;对猪产生肺水肿综合症(PPE),并可能诱发人类的食道癌等疾病,从而对畜牧业及人类的健康构成威胁。目前已知有7种衍生物。伏马毒素检测方法主要有免疫亲和柱-荧光法、免疫亲和柱-HPLC法、毛细管电泳法、液相/质谱法等。

伏马毒素的免疫亲和柱-荧光法是将样品与提取液混合、均匀、过滤,然后将滤液通过键合有伏马毒素特殊抗体的FumoniTest分离柱。此时,伏马毒素键合在分离柱中的抗体上。用蒸馏水将免疫亲和柱上的杂质除去。用淋洗液通过分离柱,将伏马毒素从抗体上分离下来。最后,将淋洗液注入荧光计进行测定,并可通过高效液相色谱(HPLC)进行准确定量和确认。本文旨在探讨利用免疫亲和柱-荧光法检测饲料中伏马毒素的方法性能。

 

1材料与方法

1.1 试剂

1.1.1 甲醇:色谱纯。

1.1.2 甲醇+水(8+2)。

1.1.3 氯化钠。

1.1.4 PBS缓冲溶液:称取8.0g氯化钠,1.2g磷酸氢二钠,0.2g磷酸二氢钾,0.2g氯化钾,用990mL纯水溶解,然后用浓盐酸调节pH值到7.0,最后用纯水稀释至1000mL

1.1.5 吐温-20/PBS溶液(0.1%):取1mL吐温-20,加入PBS缓冲溶液并定容至1000mL

1.1.6 pH7.0磷酸盐缓冲溶液:取25.0mL 0.2mol/L的磷酸二氢钾溶液与29.1mL 0.1mol/L的氢氧化钠溶液混匀后,稀释到100mL

1.1.7显色液的制备

20µL显色液B加入到显色液A中,备好后,置于室温即可。不用时应拧紧瓶塞。该混合液有效期为5天。

直接用移液器及吸头从显色液容器中移取1mL AB的混合液,切勿用分配器移取。混合液待用时要拧紧瓶塞。

1.1.8 伏马毒素标准品B2

1.2 设备与材料

1.2.1 高速均质器:18000r/min~22000r/min

1.2.2 伏马毒素免疫亲和柱(由北京中检维康技术有限公司提供)。

1.2.3 玻璃纤维滤纸:直径11cm,孔径1.5μm

1.2.4 玻璃试管:直径12mm,长75mm,无荧光特性。

1.2.5 空气压力泵。

1.2.6 荧光分析仪。

1.2.7 高效液相色谱。

1.3 方法

1.3.1 将伏马毒素B2的标准品配制成溶液后往饲料中添加,分别制成0.82.03.24.0

mg/kg的样品。

1.3.2 样品的提取

50g研磨的样品+5g +100mL的甲醇:水(8020)溶液混匀,高速均质1分钟,槽纹滤纸过滤。

1.3.3 稀释、过滤

40mLPBS/0.1% Tween-20清洗缓冲液稀释10mL上述提取液,1.0µm微纤维滤过滤。

1.3.4 亲和柱色谱操作

10mL的稀释提取液通过亲和柱,用10 mL PBS /0.1% Tween-20清洗缓冲液清洗亲和柱;将10 mLPBS通过亲和柱。用1mL的色谱级甲醇淋洗亲和柱,提取液收集于测试管中。

1.3.5 伏马毒素的测定

向试管中加1.0mL的显色液A和显色液B的混合液,然后插入荧光计,4分钟之后读数。

 

2 结果与分析

2.1 线性范围(猪配合饲料)

       厂家提供伏马毒素测量范围在0~6mg/kg。我们设定0~5 mg/kg范围,测得相关系数为0.9589,与厂家说明基本吻合。

 

2.2 回收率

伏马毒素B2在猪配合饲料中添加的回收率

添加浓度(mg/kg)

0.8

2

3.2

4

实测浓度(mg/kg)

0.6

2

2.3

4.4

回收率(%

75

100

71.88

110

 

测得平均回收率为89.22%。样品的混合均匀程度和蛋白质的污染问题是影响免疫亲和柱-荧光光度法回收率的主要因素。由于各样品中分布的伏马毒素含量不同,甚至同一样品中不同部位的伏马毒素浓度也不一样,因此混合一定要均匀。显色液会腐蚀含蛋白质的物体,所以一定要确保显色液、淋洗液及移液器吸头避免接触含蛋白质的物体(如手指)。饲料样品本身蛋白质含量的高低也会影响免疫亲和柱-荧光光度法的回收率。

 

2.3 重复性

2 变异系数

添加浓度

(mg/kg)

重复值

变异系数

CV

2

2.1

2.3

2.5

2.2

7.51

4

4.4

5.2

4.3

4.1

10.73

       变异系数均小于15%

 

2.4 确认试验

       串珠镰刀菌在繁殖过程中常会产生多种伏马毒素,有B1B2B3;等,都具有较强的毒性。利用上述方法所得的同一个样品提取液,若利用高效液相色谱法测定,既可对伏马毒素B2进行确认,又可对其准确定量,还可同时测出伏马毒素其它组分B1B3的含量。

2 伏马毒素的标准图谱2.5 mg/kg伏马毒素标准(5 B1:2 B2: 1B3)

 

 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


3 结论与讨论

免疫层析亲和-荧光光度法既可适合大批量样品检测,也适合小批量样品的检测,在检测过程中,无须大量的有机溶剂,检测过程更加安全,因此,利用免疫亲和柱-荧光法对伏马毒素进行检测具有快速、准确、安全的特点。

中心实验室 发布时间:  2017/8/15 13:06:00 浏览量:  38