信息资源 >> Y001激光共聚焦操作规程与注意事项

Leica激光扫描共聚焦显微镜

仪器型号:Leica TCS SP8

仪器编号:Y001、Y002

 

操作规程

一、   开机

1.固体激光器:

 依次打开电脑桌右侧“PC Microscope”、“Scanner Power”三个圆形按钮,然后将”Laser Emission”钥匙顺时针旋转90度至”On-1”位置。记录开机时间。

2.打开显微镜(CL6000)电源和荧光(EL6000)电源。

3.打开电脑开关,双击电脑显示屏桌面上的“LAS X”图标启动徕卡共聚焦软件。

4.如需使用快扫系统,在“Resonant Scanner”选项前“On”。

5.点击“OK”以打开软件。打开后显示LAS X基本界面。

6.点击Laser, 打开激光开关。

 

二、在显微镜下观察样品

1.选择合适的物镜,可通过显微镜上的触屏模式转换不同模式,或软件中的“Objectives”键进行选择。

2.将样品置于载物台上,在明场条件下选择合适的视野。通过显微镜主机右侧的按钮进行调焦,通过显微镜主机左侧的“INT”功能键调节光强。

3.按“TL/IL”功能键转换至荧光观察方法,通过显微镜前面板的按钮选择合适的荧光滤块,进行样品的荧光观察。

4.观察完毕后,按显微镜前面板上的荧光“SHUTTER”键以保护样品。

 

三、采集共聚焦图像

1.点击“Aquire”进行光路设置。调用已有的设置:选择“Load/Save single setting”下拉菜单中已有的设置(激光及其输出功率、分光镜、检测波长范围、PMT的gain及offset),常用的荧光染料都已包含在内。选择某一设置后,可按样品的实际需要对参数进行优化(如后述),并以新的名称保存。

修改已有设置:可改变所选激光、调节激光输出功率、改变分光镜、改变所选PMT、调节PMT检测范围、调节PMT的gain或offset等。

2. 建立新的设置:也可从零开始建立新的设置。选择所需激光及其功率、适宜的镜、PMT及检测波长范围。对于双重或多重染色的样品,可选择同时采图或序列采图的方式。推荐使用后者,因其可避免染料交叉派发和串色导致的结果不准确。进行序列扫描前,需分别设置每一通道的采图参数。

3.透射光检测器的选择单击“Additional Channels”以显示透射光检测器(“PMT Trans”),选择观察方法(BF、DIC等)。

4.选择扫描模式在“Acquire”菜单本部门的“Acquisition”中选择扫描模式(“Acquisiton Mode”)。默认模式为xyz扫描,是最常用的扫描模式,可用于xy扫描和z轴层切(xyz扫描)。还可按样品扫描需要在下拉菜单中选择由x,y,z,t(时间)以及λ(波长)组合而成的多维扫描模式。Xzy,xyt,xyλ,xyzt,xyzλ,xyzλt等。

5.设置扫描参数。在“Acquire”菜单栏的“Acquisition”中设置扫描参数,包括分辨率pixel format、扫描速度(scanning speed)、针孔大小(pinhole size)、线平均(line averaging)、面平均(frame averaging)、累加(accumulation)及放大倍数(ZOOM)等。

分辨率:默认值为512×512。也可选择更低或更高分辨率。分辨率越高,所获取的图像文件也越大。扫描速度:默认值为400Hz。活细胞或运动的样品成像可能需要更快的速度。可选择双向扫描(bidirectional scanning)来达到更高速度,这时可能需要进行相位(Phase)调节。针孔大小:默认值为1Airy。如果样品的荧光非常弱,可通过增大针孔直径来增加信号强度,但所获取图像不是真正的共聚焦图像。平均:用于降低背景噪音。分为线平均(Line averaging)和面平均(Frame averaging),线平均较快。可在下拉菜单中选择平均的次数。两种平均方式可结合使用。累加:仅用于荧光非常弱的样品。

6.预览图像点击“Live”以设定的扫描参数预览图像,图像将显示在右侧的显示屏上。

7.优化扫描参数预览图像时,调节z轴位置找到最适合观察的焦平面,并调节PMT的电压(PMT gain)及偏移(PMT offset),或激光输出功率使图像达到最佳。可通过控制面板上相应旋钮调节以上参数。理想的荧光图像中应该只有少数象素点达到饱和(即灰阶为255)可通过位于图像左侧的LUT按钮进行观察。LUT按钮可在LUT(即指定的荧光颜色)、“Glow Over Under(GlowOU)”和灰度图三档之间切换。在GlowOU中,灰阶为255的象素点显示为蓝色,而灰阶为0的象素点显示为绿色。调节PMT的电压使图像中仅少数象素点显示蓝色。应使用较低的激光输出功率和较高的PMT电压值,这有助于保护样品免受光漂白的影响。可通过调节PMT的偏移值来降低图像的背景。荧光图像PMT偏移的默认值为0%,且调节过程中不应使其大于0%。

对透射光图像,同样可以调节透射光PMT的电压和偏移值来进行优化。但有时可将偏移值调至高于0%以增加对比度。图像调至满意后,单击“Stop”终止预览过程。

8.采集图像。单击“Capture Image”采集图像。在此之前可改变分辨率、线/面平均次数等扫描参数。通常情况下,预览图像时选择512×512的分辨率,而采集图像时可增加至1024×1024。

 

四、序列扫描

如果样品采用两种或两种以上荧光染料标记,为避免串色对实验结果的影响,可采用序列扫描的方式。

1.单击“Acquisition”中的“seq”按钮,软件界面中将出现序列扫描菜单,可通过“Scan 1”右侧的“+”添加更多的扫描序列(“Scan 2”,“Scan 3”……)。

 2. 调用所需的单一采图设置,预览并优化参数至满意后,点击“Scan 1” 将参数定义至第一扫描序列。

 3. 同法定义“Scan 2” 及更多的序列。

 4. 扫描顺序“between lines” 适合大多数的应用,特别是活细胞成像。

 5. 调整分辨率、线/面平均次数等扫描参数后,点击“Start”进行序列图像的采集。

 6. 可保存序列扫描的设置以便将来调用。

 

五、z轴层切(xyz扫描)

1. xyz扫描模式为默认采图模式。

2. 选择“z-Galvo”,用SuperZ 进行z 轴调节;或“z-Wide”,用显微镜物台进行z 轴调节。

 3. 设置采图参数,方法同前。

 4. 点击“Live” 进行图像预览。用控制面板的“Z-Position” 旋钮调节z轴至层切所需的起点,点击“Begin”上方的黑色箭头定义层切起点(箭头变为棕色表示已定义);调节z轴至层切所需的终点,点击“End”上方的黑色箭头定义层切终点。

 5. 点击“Stop”终止图像预览。

 6. 此时xyz 层切菜单中显示的“z-step size”(相邻两个光切面的间距)和“Nr. of steps” (层切数目)为系统的优化值(“system optimized”)。也可点击“Nr. of steps”左侧的按钮,然后对相邻光切面间距或层切数目进行自定义。

 7. 点击”Start”进行xyz 图像的采集。

 8. 采图完毕后,应点击“Begin”和“End”上方的棕色箭头,使其变为黑色,重新处于未定义状态。

 

六、关机

1. 保存已采集的图像。

2. 关闭显微镜汞灯电源。

3. 若使用过油镜,需用无水乙醚与无水乙醇混合液(体积比7:3)或无水乙醇清洁镜头。

4. 关闭LAS AF 软件。

5. 将电脑桌右侧“Laser Power” 按钮右侧的激光开关钥匙(Laser mission)逆时针旋转90 度至“On-0” 位置。

6. 关闭“Scanner Power”按钮。

7. 在电脑上进行图像数据的输出。

8. 关闭电脑后,关闭“PC Microscope” 按钮。

9. 风扇停止后(关闭激光开关钥匙约15 分钟后),关闭“Laser Power”按钮。记录关机时间、仪器状况等信息。

 

仪器维护

1.保持光学元件的清洁对于保证好的光学性能来说非常重要,当显微镜不用时,显微镜应当用仪器提供的防尘罩盖住。

2.若暂时不使用,可以将显微镜灯光调至最暗,不能频繁开关显微镜电源。

3.调焦时注意不要使物镜碰到试样,以免划伤物镜。   

4.亮度调整切忌忽大忽小,不要过亮,影响灯泡的使用寿命,同时也有损视力。  

5.所有(功能)切换,动作要轻,要到位。   

6.关机时要将亮度调到最小。

7.目镜和物镜若被不小心弄脏,可以用擦镜纸沾擦镜油或无水乙醇,轻轻拭擦,以免损伤目镜。

 

注意事项

1. 在电脑上进行图像数据的输出时,要注意使用空白光盘刻录,而不得使用任何其他形式的移动存储介质。

2.激光共聚焦的样品首先要尽量保持生物材料的天然状态,避免赝像、变形和失真,因此须将生物材料做固定处理;制片必须薄而透明,才能在显微镜下成像,除将材料切成薄片或通过轻压或其他手段使之分散外,还需采用其他方法使它透明和染色,以便更好地观察到结构的细节。需长期还应进行脱水和封固。

中心实验室 发布时间:  2017/8/15 13:21:00 浏览量:  28